脑出血造模：胶原酶，还是自体血
你想研究“血肿怎么伤脑”，前提是先造出一个你可以控制的血肿。人身上的血肿你只能观察，不能决定它出多少血、出在哪、出多快；动物模型把这几个变量变成你能拨的旋钮。这一页讲清四种植入方法各自复制了脑出血的哪一段、牺牲了哪一段，以及台面上那几个真正决定成败的参数。红线带编号＝12 条注释卡（悬停看原文与失味点，点击跳转）。英文原文与两篇经典原始文献的摘要附于文末。
脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是所有卒中亚型里最致命的一种，而它至今没有一种被证明有效的治疗。临床试验做过各种手术，结果没有一个能优于现有内科管理。在这样的背景下，动物模型成了唯一能回答“出血之后脑内到底发生了什么”的工具——但工具本身决定了你能问什么问题。这一页要解决的就是这个选择问题：站在鼠台前，你手上该拿胶原酶还是自体血。
本篇精译自 Tzu Chi Med J 2023 年的方法学综述《Experimental animal models and evaluation techniques in intracerebral hemorrhage》（35(1):1–10，DOI 10.4103/tcmj.tcmj_119_22，PMID 36866349），覆盖摘要、引言与四种造模方法的全部正文；英文附录另附该文表格与两篇经典原始文献的公开摘要（Rosenberg et al., Stroke 1990；Deinsberger et al., Neurological Research 1996），因为台面上真正要抄的参数来自它们。
一、先接受一个事实：没有一种模型像临床
先把最不舒服的结论放在开头。原文的判断是：现有模型没有一个能贴近临床所见脑出血的严重程度（none of the current models closely represent the severity of ICH seen in clinical settings）。理由很直接——临床上的血肿往往更大，治疗方案的制定取决于血肿的体积和位置；而动物模型里，血肿体积与“按体积和位置制定治疗方案”这两件事从来没有真正对上过。这意味着你在论文里看到的每一个“ICH 模型”，都只是脑出血的某一个切面。
那临床的脑出血长什么样？原文给的分布是：出血通常发生在基底节区，其中壳核（putamen）最多，约占全部脑出血的 50%；其次是丘脑（thalamus）约 15%、脑桥（pons）约 15%、小脑约 10%。亚洲人群的卒中患病率明显高于西方人（20%–30% 对 10%–15%）。存活的 ICH 患者中有三分之二遗留中重度残疾。这几句话解释了为什么绝大多数造模文献把针扎进纹状体（striatum，大鼠的尾状核-壳核）：它对应人类最好发的壳核出血。
再看病理过程，因为它决定了模型该怎么选。原文把脑出血后的脑损伤分成两段。第一段是原发性脑损伤（primary brain injury, PBI）：血管破裂、血肿形成，血肿对脑实质产生机械挤压，颅内压（intracranial pressure, ICP）升高、脑灌注压（cerebral perfusion pressure, CPP）下降，大的血肿可以造成脑疝并致死。血肿通常在 24–48 小时内继续增大。第二段是继发性脑损伤（secondary brain injury, SBI）：漏出的血触发凝血级联，立刻产生并激活凝血酶（thrombin），激活小胶质细胞，造成血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）破坏、早期脑水肿与神经元凋亡；随后血肿内溶血持续数小时到数天，释放血红蛋白及其降解产物（血红素、铁、降解的血红素产物），活性氧（reactive oxygen species, ROS）升高，造成延迟性水肿与神经炎症。
把这两段记住，四种模型的分工就一目了然了：球囊只复制 PBI 里的“挤压”，自体血复制“一次性放入的血和它的降解产物”，胶原酶复制“持续出血＋血肿扩大＋外源酶的炎症”，凝血酶只复制 SBI 里的一条分子通路。选模型，本质是选你要复制哪一段、并接受其余部分失真。
二、三条硬要求：可重复、可量化、可对照
判断一个造模方案能不能用，不用看它多复杂，只看三件事是否同时成立。这三条不是原文的行文结构，而是从原文的表格与讨论里抽出来的判据；每一条对应一种会让你整批数据作废的失败方式。
第一条：可重复——同一手术、同一剂量，出血量要落在同一个范围里
原文评价胶原酶模型时用的词是“高度可重复”（highly reproducible），靠的是控制细菌胶原酶的剂量；评价自体血模型时用的词是“缺乏可重复性”（lack of reproducibility），原因是血会随机渗入蛛网膜下腔与脑室系统。这两种“可重复”说的都是同一件事：在同样的手术、同样的剂量下，血肿体积的离散度要小到能让你看出组间差异。如果同一组动物里血肿体积从 5 µL 到 40 µL，那么后面所有的行为学、分子生物学比较都建立在噪声上。
这里要小心一个语义陷阱。“reproducible”在论文里通常指统计上的稳定（同一实验室、同一术者、同一批动物），而不是“别的实验室照做也能得到同样的结果”。后者叫可迁移性，需要另一套证据（多中心、独立重复）。原文没有提供后者，你也不该替它补上。
第二条：可量化——出血量、血肿体积、水肿程度要能被测出来
原文的表 1 把评估参数分成四栏：血肿大小（hematoma size）、功能结局（functional outcomes）、BBB、分子与细胞效应。这四栏其实就是四种“量化出口”：解剖学的、行为的、屏障的、分子的。一个合格的造模报告至少要给出其中两栏，而且最好是互相独立的两种方法——因为每一种都有自己的系统性偏差（第九节展开）。
最容易被忽略的是时间点。血肿在 24–48 小时内还会变化，水肿在 24–72 小时达峰，BBB 通透性在胶原酶模型里 30 分钟就开始升高。你在哪个时间点取材，决定了你能看到什么；时间点选错，不是数据不好，是问题问错了。
第三条：可对照——假手术（sham）到底做什么
这是本科生最常问、也最容易做错的一条。假手术不是“什么都不做”，而是“把所有侵入性步骤都做一遍，唯独不给致病因素”。具体到脑出血造模，一个完整的 sham 应该包括：同样的麻醉与麻醉时长、同样的立体定位固定、同样的切皮与钻孔、同样把针下到同一坐标同一深度、注射等体积的载体（生理盐水或磷酸盐缓冲液）、留针同样长的时间、同样缓慢拔针、同样缝合与术后护理、同样的镇痛。
为什么非要做这么全？因为钻孔本身、针道本身、麻醉本身都会引起胶质细胞反应、局部水肿和轻微的 BBB 改变。如果 sham 只是“麻醉后缝合”，你和实验组之间的差异里就混进了“开颅＋穿刺”这一块，而且是无法拆分的一块。原文没有写 sham 的具体操作——这是实验设计层面的通行做法，不是这篇综述的内容，你要按自己课题组的 SOP 写清楚，并在方法学里逐条列出 sham 做了哪些、没做哪些。
三条要求之间有依赖关系：不可重复，量化就没有意义（测的是噪声）；不可量化，对照就没有意义（不知道差异有多大）；不可对照，前两条都白做（不知道差异来自哪里）。
三、胶原酶模型：把血管的地基泡软
这是目前用得最多的一种。做法是沿立体定位坐标把细菌胶原酶（bacterial collagenase）注入纹状体。它的逻辑不是“扎破一根血管”，而是“把血管赖以附着的基底膜消化掉”。Rosenberg 1990 年的原始观察是：注入后 1 小时内即可见血管周围的红细胞，血肿在 4 小时内成形，而血肿的大小随胶原酶剂量变化；24 小时出现坏死团块，7 天出现充满脂质的巨噬细胞，3 周形成囊腔。原文引用这项工作时特别点出机制：脑组织的基底膜里含 IV 型胶原，胶原酶把它降解，血管壁失去支撑，于是“血管爆裂，即使在数小时之后仍会有明显出血”。
这句话是理解整个模型的钥匙。血肿扩大（hematoma expansion）在这里不是偶然现象，而是模型的固有属性：注射的酶在组织里继续起作用，出血会持续数小时。原文描述临床病程时也强调血肿通常在 24–48 小时内继续增大——胶原酶模型是四种模型里唯一“自带你想要的这个动态过程”的。原文的措辞因此是“与临床 ICH 最相似”（closest to clinical ICH），而不是“最准确”。
剂量参数要格外小心。原文写的是 0.01–0.1 单位细菌胶原酶溶于 0.5–2 mL 载体注入大鼠或小鼠纹状体。这两个数字是有问题的：它自己引用的 Rosenberg 方案是 0.5 单位溶于 2 µL；而 2 mL 打进鼠脑在物理上不可能（成年大鼠全脑约 2 mL）。所以合理判断是：体积单位应为 µL 级，剂量区间在原始文献之间差别很大（不同品系、不同靶点、不同酶批次的活性单位并不等价）。这一点不是原文的说法，是我根据原文内部矛盾做的判断，你抄参数时必须以原始文献和你所在实验室已建立的条件为准，并且每次换酶批次都要重新标定。原文反复强调的“通过控制剂量获得高度可重复性”，前提正是剂量本身被正确标定过。
它复制了什么：真实的血液成分（红细胞、血红蛋白、血红素、铁）、真实的凝血酶生成、真实的血肿扩大、真实的长期功能缺损。原文表 1 对胶原酶模型的记录是：21 天时“未观察到功能恢复”，2 个月时恢复很少见；BBB 通透性升高从注射后 30 分钟就开始；中性粒细胞在 3 天时出现；TUNEL 阳性细胞从 24 小时持续到 21 天；血红蛋白降解产物与细胞死亡相关。
它牺牲了什么：炎症背景被外源蛋白污染。细菌胶原酶对人体是异种蛋白，它本身就会招募炎症细胞、激活小胶质细胞；剂量越高，这部分“与出血无关的炎症”越重。原文在讨论里承认了这一点（尽管措辞温和：该模型“可能放大炎症反应”）。其次是出血方式：模型里是小血管弥漫性渗漏与爆裂，临床上是动脉破裂的高速喷出，两者的血肿形态、周围组织剪切力、甚至血肿内的压力梯度都不同。第三是血肿边界：酶在组织里扩散，边界模糊，做“血肿周围区”的定量时，取材范围本身就带主观性。
适合回答：血肿扩大是怎么发生的、血红蛋白与铁的毒性、延迟性水肿、长期（数周到两月）功能缺损、以及任何需要“血肿还在长”这个前提的干预实验。不适合回答：纯粹的抗炎药效评价（因为你分不清压住的是血肿引起的炎症还是酶引起的炎症）、精确的“占位效应”研究（体积不可控的部分太多）、以及把结果直接外推到“人动脉破裂后第一天”的临床情景。
四、自体血模型：把血打进去，再堵住针道
做法是从动物尾静脉（或心脏、股动脉）取自体血，不抗凝，经立体定位注入纹状体（caudate-putamen）。它的优点是干净：注入的是同种、同个体的全血，没有外源蛋白，没有酶，血肿的成分与临床最接近。原文特别点出操作上的关键——整个过程必须无菌，取血与注射之间不能凝血。
它的时间曲线与胶原酶几乎相反：血肿在 4 小时内就稳定下来，不再继续长大，4–6 周被吸收；21 天时功能完全恢复；BBB 通透性升高只出现在血肿边缘；中性粒细胞在 24 小时达峰、3 天时反而耗竭；3 天时未检测到铁蛋白升高。也就是说，这个模型把脑出血压缩成了一次性事件：血进去，然后被清理。
它的核心缺陷是可重复性差。原文的原话是“缺乏可重复性”，机制写得很具体：注入的血液可能反流到蛛网膜下腔、破入脑室系统，导致血肿的大小与范围不可控。这不是手法粗糙的问题，是物理问题——针道是一个开放通道，你打进去的液体总会找阻力最小的方向走。
Deinsberger 1996 年给出的解法值得单独讲，因为它是“用操作对抗物理”的典型：双注射法（double injection）。先注入少量新鲜自体血，让它凝固、堵住针道（预凝，preclotting），然后再注入主体血量。原文引用的结果是：19 只雄性 SD 大鼠，总量 50 µL，形成的血肿为 41.1 ± 10.0 µL，形状相似。这个数字要会读：注入 50 µL、回收 41 µL，说明约有 9 µL 留在了针道或溢出；而 ±10 µL 的标准差意味着单只动物的血肿可能在 30–50 µL 之间波动。对行为学实验来说这个离散度是可以接受的（因为组间差异通常按均值比较），但如果你想做“血肿体积与某个分子表达量的相关分析”，这个噪声就会吃掉大部分信号。
它牺牲了什么：没有血肿扩大，因此不能用来研究再出血；没有血管破口，因此缺少临床出血时血管壁损伤与血小板活化的原位过程；血是“死的”——离开血管的血已经开始凝，纤维蛋白网络、血小板颗粒释放、红细胞形态都与体内正在漏出的血不同。注射速度、针径、血温都会影响最终的凝块结构，而这些参数在多数论文里写得不够细。
适合回答：血肿占位与血成分的一次性损伤、需要稳定初始血肿体积的剂量效应研究、需要“无外源蛋白”背景的炎症或免疫研究、以及作为胶原酶模型的对照模型（两种模型结论一致时，可信度显著提高）。不适合回答：血肿扩大、再出血、以及任何需要“出血持续进行”的机制问题。
五、微球囊模型：只复制占位这一件事
这是四种模型里最“物理”的一种，1987 年首次建立。做法是把一个可充盈的微球囊（microballoon，原文注明是栓塞球囊 embolization balloon）经立体定位送入右侧尾状核，原文给的坐标是：前囟前 1 mm、前囟右侧 4 mm，插入深度 5 mm。然后在 20 秒内充盈，保持 10 分钟，再放气拔出。
它复制的是纯粹的机械事件：球囊充盈造成局部组织挤压、ICP 升高、CPP 与脑血流（cerebral blood flow, CBF）下降。放气后 6–24 小时可观察到凋亡，10 分钟与 120 分钟时可观察到坏死神经元。反过来，它没有血肿形成、没有 BBB 渗漏、没有血液成分。原文用“no hematoma formation”“no BBB leakage”这样的否定句来界定它，这在方法学上非常诚实：作者是在明确告诉你这个模型不含什么。
取舍因此很清晰。适合回答：占位效应本身（ICP、CPP、CBF、脑疝）的因果链、机械压迫导致的神经元死亡、以及“不含血液成分时脑损伤能到什么程度”这个对照性问题。不适合回答：任何与凝血、溶血、铁、血红素、炎症相关的继发性损伤；也不适合长期功能结局，因为原文指出该模型缺乏长期功能结局的数据。
它还有一个隐藏变量：充盈时间就是剂量。原文明确写到，球囊充盈时间过长会造成不可逆损伤。这句话的意思是，这个模型的“出血量”不是一个体积数，而是一个“压力×时间”的积分；两个实验室都写“球囊压迫 10 分钟”，但球囊的顺应性、充盈介质（空气还是生理盐水）、实际达到的压力可能完全不同。要复现，必须报告压力或充盈体积，而不只是时间。
六、凝血酶模型：只复制一种分子
做法更简单：只注射凝血酶（thrombin），不注射血。它回答的是一个还原论问题——如果脑内只有凝血酶这一种东西，会发生什么？原文引用的结果是：注射凝血酶 5 天后出现认知缺损；出现活化的小胶质细胞与巨噬细胞；而在另一项脑室内出血（intraventricular hemorrhage, IVH）研究中，凝血酶对 BBB 的破坏被判定为“无关”。
这个模型的定位不是“另一种 ICH 模型”，而是“一条通路的工具”。它的价值在于干净：没有红细胞、没有占位、没有铁，只有一种蛋白酶及其下游（蛋白酶激活受体、凝血级联、炎症）。做凝血酶抑制剂、做 PAR 受体敲除、做剂量-反应曲线，它是最省变量的选择。
它的局限也很干净：它不是脑出血。临床脑出血的损伤是“占位＋血成分＋凝血酶＋铁＋炎症”的叠加，单独一条通路能解释的方差通常很小。原文对此的态度是把它并列在四种模型里，但没有推荐它作为整体 ICH 模型。另外要注意剂量：凝血酶本身有直接的细胞毒性，浓度过高时你测到的是“蛋白酶把细胞消化了”，而不是“凝血酶受体的信号”。
适合回答：凝血酶通路的因果与剂量效应、凝血酶抑制剂的体外与在体筛选、以及“去掉血液成分后炎症还剩多少”的减法实验。不适合回答：血肿体积相关的任何问题、整体神经功能结局、以及需要血肿自然病程的实验。
把这四种模型放在一起看，它们其实构成一组减法对照：自体血＝全血（有占位、有血成分、无扩大）；胶原酶＝全血＋持续出血＋外源酶（有扩大、炎症被放大）；微球囊＝只有占位（无血成分）；凝血酶＝只有一种血蛋白（无占位、无细胞成分）。你要回答的问题落在哪一格，就用哪一种；如果一个问题需要两格同时成立（例如“扩大过程中铁的毒性与占位各占多少”），那就得两个模型一起做，并在讨论里说明为什么两个结论能互相支持。
七、四种模型并排：一张选型表
表 1 四种脑出血造模方法的对照。表中“血肿扩大”“可重复性”“炎症背景”三栏综合原文正文与表 1；括号内为原文未直接给出、由模型机制推出的判断。
| 模型 | 复制了什么 | 血肿会扩大吗 | 可重复性 | 炎症背景 | 最适合回答 | 最不适合回答 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 胶原酶 | 全血＋持续出血＋外源酶 | 会（数小时） | 高（靠剂量控制） | 被细菌蛋白放大 | 血肿扩大、铁/血红素毒性、延迟水肿、长期缺损 | 纯净的抗炎药效、精确占位效应 |
| 自体血 | 全血，一次性放入 | 不会（4 h 内稳定） | 中（双注射后改善） | 接近“只有血” | 血成分损伤、稳定初始体积、无外源蛋白的免疫研究 | 再出血、血肿扩大 |
| 微球囊 | 只有机械占位 | —（靠压力×时间） | 中（依赖压力标定） | 无血液成分 | ICP/CPP/CBF、机械压迫致神经元死亡 | 凝血、溶血、铁、炎症 |
| 凝血酶 | 单一血蛋白通路 | 不会 | 高（剂量可控） | 只有凝血酶通路 | 凝血酶因果、抑制剂筛选、减法实验 | 血肿体积、整体功能结局 |
这张表可以直接当决策树用，顺序是：先问“我的问题里有没有‘扩大’两个字”——有，就只剩胶原酶；再问“有没有‘占位’”——有，就在自体血与球囊之间选，选哪个取决于你是否需要血液成分；再问“是不是只关心一条分子通路”——是，凝血酶。三步之后还没有答案，说明你的问题本身需要拆成两个实验。
还有一个实践层面的判断：如果你要做的是“干预组 vs 对照组”的组间比较，且主要终点是行为学或分子表达，胶原酶与自体血都可以，但样本量估算要用各自的变异系数（自体血的体积变异明显更大）；如果你要测的是血肿体积本身的变化，胶原酶更敏感，因为它的效应量更大。原文没有给样本量建议，这是实验设计层面的事，需要按预实验的均值与标准差自己算。
八、手术台面：从上针到关颅
这一节是给要真正上手的人看的。先说明来源边界：只有坐标（球囊模型）、剂量（胶原酶）、注射体积（自体血）三组数字来自原文或它引用的原始文献；其余参数在文献里高度分散，本节写作“常见范围，因实验室而异”，你抄进自己 SOP 时必须用本实验室已建立的参数，并做预实验验证。
1. 麻醉与监测
常用异氟烷（isoflurane）诱导 3%–4%、维持 1.5%–2.5%（常见范围，因实验室而异）；也可用氯胺酮/赛拉嗪组合，但麻醉深度不易稳定，对体温与血糖影响更大。麻醉深度用趾间反射与呼吸频率判断，角膜反射消失即进入外科麻醉期。体温必须维持在 37 ± 0.5 °C：用直肠探针加反馈式加热垫，因为低体温本身就有神经保护作用，会把你的“损伤组”变成“治疗组”。眼睛涂眼膏防止角膜干燥。这些是外科麻醉的通用要求，不是这篇综述的内容。
2. 固定、备皮、消毒
把动物装上立体定位仪（stereotaxic frame）：先固定门齿杆（齿杆高度按仪器说明书，鼠与兔不同），再插入双侧耳杆，两侧刻度对称，头部不能有左右晃动。剃去颅顶毛发，碘伏消毒三遍、酒精脱碘，铺无菌洞巾。切皮前皮下给镇痛药（常用非甾体类或阿片类，剂量按本机构动物伦理规定），并在切口处追加局部麻醉。
3. 坐标
所有鼠脑坐标以前囟（bregma，冠状缝与矢状缝的交点）为原点。纹状体注射的常见坐标是：前囟前 0.2 mm、旁开 3.0 mm、深 5.0–6.0 mm（大鼠，常见范围，因实验室而异）；小鼠要按 1/10 体积比例缩放并重新查图谱。原文引用的球囊模型用的是前囟前 1 mm、旁开 4 mm、深 5 mm（右侧尾状核）。注意三点：方向必须写明（前/后、左/右）、深度基准必须写明（硬脑膜表面还是颅骨外板）、以及不同品系与周龄的脑大小不同。**坐标错了，后面所有数据都是另一个实验。**
4. 钻孔
用牙科钻在坐标点钻直径略大于针径的孔，钻到硬脑膜即停，不要压破硬脑膜下的皮层。钻孔时用棉签吸去骨屑，避免骨屑随针带入脑内。若钻孔处渗血，用明胶海绵轻压止血，等止血后再进针——带血的针道会让“血肿体积”多出一个无法定量的来源。
5. 针与注射
针径常用 26–30 G（常见范围）；更细的针反流少，但容易被血凝块堵住，自体血模型尤其要注意。注射用微量注射泵，速度控制在 0.2–0.5 µL/min 或更慢——越慢反流越少，这是自体血模型成败的第一变量。原文只给了球囊充盈的速度（20 秒内充盈），没有给注射速度，因为球囊模型不存在反流问题。
注射完成后留针（leave the needle in place）5–10 分钟（常见范围，因实验室而异），让针道内的液体有时间凝固或扩散，然后以约 1 mm/min 的速度缓慢拔针。拔快了，针道会把刚打进去的液体带出来，你测到的血肿体积会系统性偏小。胶原酶与自体血的操作差异要记住：酶要现配现用、冰上保存、避免剧烈振荡（否则失活，实际剂量低于标称）；血要现取现用、不抗凝、排净气泡，并且要算上注射器与 PE 管的死体积。
6. 关颅、复苏、镇痛
拔针后用骨蜡或明胶海绵封闭骨孔，缝合皮肤（或使用伤口夹），切口涂碘伏。皮下补液（温生理盐水，按体重计算，常见 0.5–1 mL/100 g，因实验室而异），放在加热垫上复苏至能自主翻身，再放回笼内。术后镇痛按机构规定给药，通常覆盖 48–72 小时。
7. 术后护理与记录
单笼饲养或原笼饲养（取决于是否会打架），提供软食与易得的水。术后 24 小时内每 4–6 小时观察一次，之后每天至少两次，记录：体重（下降超过 20% 通常要安乐死或额外补液）、体温、进食饮水、姿态与活动、切口情况、神经症状（抽搐、转圈、偏瘫）。这份记录不是形式主义——它是你后面解释“为什么这只鼠的行为学数据是离群值”的唯一依据。
九、造完模，怎么证明造成功了
造模失败的动物不会自己举手。你必须用至少两种互相独立的方法，证明“血肿确实形成了、位置对了、大小落在预期范围”，然后再谈干预效果。原文表 1 把评估分成血肿大小、功能结局、BBB、分子与细胞效应四栏，下面按“从便宜到贵、从活体到离体”的顺序讲。
行为学
唯一能在同一只动物身上反复测、不需要处死的方法。常用的有改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score, mNSS）、Garcia 评分、前肢放置试验（forelimb placement test）、旷场、corner test、转棒（rotarod）。这些测验各自测什么、在 ICH 里哪个真能测出差别，见本分区 07 页《行为学：哪些测验真的测得出差别》。这里只强调一件事：行为学是造模成功与否的第一道筛子，但它对操作者的手感、时间点、光照与昼夜节律极度敏感，用它做“造模成功”的判据时，必须在术后固定时间点、由不知道分组的人来做。
MRI
最可靠的活体方法。T2 加权像上高信号区对应血肿与周围水肿，24 小时是最常用的时间点；也可以做纵向扫描，看水肿的自然演变。优点是同一只动物可以重复测、能给出体积而不是面积、能同时看对侧与脑室是否受压；缺点是需要麻醉（麻醉影响体温、血糖与行为学，扫描当天不宜再做行为测试）、设备贵、序列参数必须固定，否则不同时间点的体积不可比。原文特别指出，组织学里的 H&E 染色“必须与 MRI 结合”才能准确评估血肿——单看一张切片的血肿面积，会系统性低估不规则血肿的体积。
血红蛋白定量
最便宜的一种。取同侧与对侧半球，匀浆后测血红蛋白含量，用差值作为血量的指标。常用方法是 Drabkin 法（氰化高铁血红蛋白法），在 540 nm 附近比色；也有商品化试剂盒。这一步同样不是本综述的内容，属于通用生化方法。它的坑在取材：灌注不彻底会把血管内的血算进去（高估），血肿未完全液化时提取效率不稳定（低估），两侧取样位置不对称会引入系统误差。优点是便宜、可批量、不需要成像设备，适合作为 MRI 的交叉验证。
伊文思蓝
测 BBB 破坏的经典方法，原文写得很完整：伊文思蓝经股静脉注入、循环 1 小时，然后生理盐水心脏内灌注，取脑，用荧光法定量。原文强调它便宜、简单、可标准化，并且能给出“定量”而非“半定量”的结果；同时也提醒它有细胞毒性，以及必须配对照（未注染料的脑、注染料但未造模的脑）。
它的原理常被误解：伊文思蓝在血里几乎全部结合白蛋白，所以它测的是“白蛋白从血管漏到脑组织”，而不是“水漏出去”，也不是“血管壁的洞有多大”。原文把 BBB 与脑含水量分成两节，就是在提醒这一点。另外，脑组织本身是蓝色的（尤其灰质），肉眼判断“蓝染程度”非常不可靠，必须做甲酰胺或三氯乙酸提取后用荧光/比色定量。
组织学
H&E 看血肿面积、坏死与炎症浸润；cresyl violet 看神经元丢失（原文明确说它“不准确”）；铁沉积用普鲁士蓝（Perls）染色——这是与“血红蛋白降解产物、铁毒性”这条机制直接对应的形态学证据，虽然原文表格没有单列，但它的机制部分反复强调铁与血红素的作用，做长期时间点实验时值得加。免疫荧光看小胶质细胞（IBA1）、星形胶质细胞（GFAP）、中性粒细胞（MPO）、神经元（NeuN），方法见 04 页。做组织学时，切片层面必须固定（例如以针道为中心、每隔 200 µm 取一张），否则“血肿面积”这个指标的方差会大到无法解释。
脑含水量
干湿重法。公式是（湿重 − 干重）÷ 湿重 × 100%，湿重取新鲜脑组织称重，干重是 100 °C 烘 24 小时后称重。它的分辨率大约在 1% 量级，而 ICH 后不同组之间的水肿差异常常只有 1%–3%，所以称重必须用同一台天平、同一取材顺序、同一时间点，并且每次称重前擦净表面水分。
一句话原则
至少两种独立方法交叉验证。MRI 与血红蛋白定量测的是同一个东西（血量），但偏差方向相反；行为学与组织学测的是不同层面的东西，可以互相解释但不能互相替代。原文表 1 里胶原酶模型“21 天无功能恢复”、自体血模型“21 天完全恢复”这两个结论，如果只用一种方法，你根本无法判断是模型差异还是测量差异。
十、本科生在这一步能亲手做什么
造模是整条链里最“手艺”的一环，也是权限最低的一环。你不可能第一周就上手立体定位注射，但这不代表你只能站在旁边看。下面这些环节，是你能亲手做、做错也不毁数据、做好了还能直接进论文方法学与致谢的。
备器械与铺台。手术器械的高压灭菌、器械包的打包与开封、钻孔针与注射针的检查、微量注射器的气密性测试、胶原酶的现配（冰上、避光、不过度振荡）、自体血模型的取血针与 PE 管预冲。这些事听起来琐碎，但“酶失活”“针堵了”“管里有气泡”是造模失败最常见的原因，而它们全部发生在你手上。
麻醉记录与监护。记录诱导时间、维持浓度、体温、呼吸频率、反射、苏醒时间。这份表是后面解释“为什么这批动物的血肿偏小”的关键证据（低体温、麻醉过深都会改变结果）。做得好的麻醉记录，本身就是一篇方法学论文里“标准化”的证据。
备皮消毒。这是最能练手、又完全不影响数据的环节。剃毛范围、碘伏次数、酒精脱碘、铺巾，全部按 SOP 做。感染率是动物实验最容易被审稿人问、又最难补的数据。
术后保温与护理记录。复苏期的保温、补液、镇痛给药、体重与进食记录、神经症状观察。这些事决定你的存活率与排除率。一篇论文的 n 从 30 掉到 18，往往就发生在这一段。
盲法编号。给每只鼠一个编号，手术者知道编号但不知道后续分组，行为评分者知道编号但不知道处理；样本取材后再换一套编号。这件事必须由不参与数据分析的人（通常就是你）来维护，它是整篇论文可信度的地基，也是最容易被忽略的一步。
行为测试的观察者。学会一个量表、做到评分者内部一致性可接受，再扩到第二个。07 页会详细讲为什么这是本科生最容易做出贡献的位置。
不能碰的部分，以及为什么。立体定位上针、钻孔、注射，这三步在没有足够训练前不要碰。理由不是“危险”，而是“不可检测”：针道偏 0.5 mm，血肿就落到内囊或脑室，行为学数据会变，但你从数据上看不出来——你只会得到一批“结果不稳定”的实验，而没有人知道原因。先看 20 台，再在废弃动物或尸体上练坐标，最后在导师监督下做第一批。
怎么让“打杂”变成贡献：把记录做成可直接分析的表格（列名统一、单位统一、缺失值标记统一）；把 sham 的护理做到与实验组完全一致；把盲法编号坚持到底；把每次失败的原因写进实验日志。四件事做完，你就是这个课题组里最清楚“这批数据是怎么来的”那个人——这比多打几针值钱得多。
十一、原文承认的局限与几个必须打问号的地方
原文的局限写得很坦白：没有一个模型能代表临床 ICH 的严重程度；临床血肿更大，治疗方案取决于体积与位置；动物模型缺少与临床严重程度匹配的治疗方案。除此之外，原文还提到一种常被忽略的偏差：绝大多数 ICH 模型是在健康、年轻的雄性动物身上做的，而临床患者以老年人为主，常合并高血压、糖尿病、抗凝药物使用——这些因素都会改变血肿扩大与水肿的程度。
下面三处是我在读原文时标出的“需要打问号”的地方，写论文引用时要么核对原始文献，要么在方法学里注明依据。
其一，胶原酶剂量的单位与体积。原文写“0.01–0.1 单位溶于 0.5–2 mL”，而它引用的 Rosenberg 方案是“0.5 单位溶于 2 µL”。两者相差一到两个数量级，且 2 mL 在鼠脑内不可能。合理判断是：体积应为 µL，剂量随品系与靶点变化，不能直接照抄。这一条直接影响可重复性，是审稿人最容易抓的点。
其二，球囊的 50 mL。原文写“20 秒内充盈 50 mL”，而成年大鼠全脑约 2 mL。这几乎必然是 µL 级笔误（或 PDF 转文字时把 µL 吃成了 mL）。抄参数时用体积合理性过一遍：一个结构里装不下的体积，一定是单位错了。
其三，两种模型的免疫反应方向相反。原文表 1 记录：胶原酶模型的中性粒细胞在 3 天时出现，自体血模型的中性粒细胞在 24 小时达峰、3 天时耗竭；胶原酶模型 3 天时铁蛋白升高，自体血模型 3 天时未检测到升高。这解释了为什么同一个课题组用不同模型会得出相反的“炎症”结论——不是谁做错了，是模型本身在问不同的问题。你要做的不是选一个“正确的”，而是在论文里说清楚你选的是哪一个、它能回答什么。
最后一句总结：选模型之前，先把你想要回答的那一个问题写成一句话（“我想知道血肿扩大过程里铁离子对少突胶质细胞的影响”），再逐条检查四种模型各自牺牲了这句话里的哪一部分。写不出来，说明问题还没想清楚；写得出来，模型自己就选好了。
▲ 本页翻译难点
intracerebral hemorrhage (ICH)autologous blood injectioncollagenasereproduciblemass effecthematoma expansioninflationcranial / bregmastriatum / caudate nucleusEvans bluedry/wet weightno functional recovery附录 · 英文原文
⚠ 本附录逐字收录既定英文片段（PMC9972928.md，约 34.8K 字符；另附 Rosenberg 1990 与 Deinsberger 1996 的公开摘要），供对照与检索。机器抽取自公开全文，保留原文的引用编号与符号。
Abstract
Intracerebral hemorrhage (ICH) is the most lethal type of cerebral stroke without effective therapy. Although clinical trials with various surgeries have been conducted, none have improved clinical outcomes compared to the current medical management for ICH. Several ICH animal models, including autologous blood injection, collagenase injection, thrombin injection, and microballoon inflation methods, have been developed to elucidate the underlying mechanisms of ICH-induced brain injury. These models could also be used for discovering new therapy for ICH preclinically. We summarize the existing ICH animal models and the evaluation parameters used to measure the disease outcomes. We conclude that these models, resembling the different aspects of ICH pathogenesis, have their advantages and disadvantages. None of the current models closely represent the severity of ICH seen in clinical settings. More appropriate models are needed to streamline ICH’s clinical outcomes and be used for validating newly developed treatment protocols.
INTRODUCTION
Intracerebral hemorrhage (ICH) is the most devastating type of cerebral stroke caused by rupture of intracranial vessels or hemorrhagic transformation of cerebral infarction. Cerebral hemorrhage usually occurs in the basal ganglion, among which the nucleus (putamen) is the most common region (~50% of all cases of cerebral hemorrhage), followed by the thalamus (~15%), the pons (~15%), and the cerebellum (~10%) [[1]]. Moderate-to-severe disability in two-thirds of surviving ICH patients also caused an impact on the socioeconomic status of the patients and their families [[2]]. The prevalence of stroke in Asians is much higher than that in Westerners (20%–30% vs. 10%–15%) [[3]].
Our review focuses on the pathogenesis of ICH and briefing on the standard methods used to induce ICH brain injury in animals. Since rodents are the most used experimental models of ICH, our review revolves around the technical details of ICH induction and compare the similarities, differences, advantages, and disadvantages of the existing models. We also explain the evaluation methods, including magnetic resonance imaging (MRI), behavioral testing, and histological examination in these ICH animal models.
EXPERIMENTAL ANIMAL MODELS OF INTRACEREBRAL HEMORRHAGE
Animal models are necessary to help improve the existing therapeutic care and validate new interventions that might alleviate ICH consequences. Various animal models have been developed in practice for many years to resemble the clinical situations of ICH in humans.
provides a description of the different experimental animal models available for ICH and the advantages and the disadvantages of the experimental animal models.
[Table 1] Experimental animal models of intracerebral hemorrhage
Models | Advantages | Disadvantages | Evaluation parameters
Hematoma size | Functional outcomes | BBB | Molecular and cellular effects Collagenase injection | Highly reproducible [[34]] | Bacterial collagenase can amplify the inflammatory response and at high doses [[34]] | Hematoma size increases in the first 4 h [[35]] | No functional recovery was observed 21 days postcollagenase injection [[36]] | Time-dependent increase in the BBB permeability postcollagenase injection [[35]] | Presence of neutrophil after 3 days of collagenase injection [[37]] | | | Blood from the hemorrhage site diffuses into the brain parenchyma and the hematoma volume was greater when compared to blood infusion model at 4 and 6-weeks postcollagenase injection [[35]] | Spontaneous functional recovery was diminished at day 1 postcollagenase injection and very minimal functional recovery was found after 2 months of collagenase injection [38,39] | BBB permeability started 30 min postcollagenase injection [[40]] | Dying neurons were observed as long as 21 days postcollagenase injection [[37]] Autologous blood injection | Blood injection causes mechanical damage associated with mass effect [[41]] | Blood disruption and penetration into the subarachnoid and ventricular spaces which is unavoidable after blood injection [[42]] | Stable hematoma size during the first 4 h [[35]] | Complete functional recovery was observed after 21 days of blood injection [[36]] | Decreased time dependent blood–brain barrier permeability [[35]] | Neutrophil depletion was observed at day 3 postblood injection [[37]] | Blood injection model is sterile as it does not involve any exogenous proteins [[34][42]] | Lack of reproducibility [[43]] | Hematoma resolved quickly when observed between 4 and 6 weeks [[35]] | Neurological severity score and corner test showed partial recovery between day 1 and day 28 postblood injection [[38]] | BBB permeability was observed only in the rim of the hematoma [[44]] | Increased number of dying neurons was found from day 2 to day 7 postblood injection [[37]] Microballoon inflation | Effective in reducing the cerebral blood flow and increasing the intracranial pressure [[45]] | Must be performed within a limited time window to prevent irreversible brain damage [[46]] | Since there is no chemical disruption to disrupt tissues for bleeding to cause hematoma, this model does not induce hematoma formation [[47]] | No available information on the functional outcomes after microballon inflation | No BBB leakage can be traced | Microballoon inflation model causes cell death by apoptosis from 6 to 24 h after deflation [[48]] | Exerted systemic effects on cerebral perfusion pressure [[47]] | Cannot evaluate the secondary brain injury caused by blood elements and blood brain barrier disruption [[41]] | | | | Necrotic neurons were present in the microballoon inflated area in the brains of the animals for 10 or 120 min [[48]] Thrombin injection | Advantageous in learning the effect of thrombin[[49]] | Cannot investigate other blood components other than thrombin [[50]] | Not considered in most of the studies as this model is used to analyze the role of thrombin | Cognitive deficit lasted for 5 days after intrastriatal injection [[51]] | Thrombin is said to have effects on BBB disruption in intraventricular hemorrhage [[52]] | Activated microglia and macrophages was observed after intrastriatal injection of thrombin [[51]]
Collagenase injection
The collagenase injection model requires the injection of various amounts (0.01–0.1 units in 0.5–2 mL) of bacterial collagenase into the rat striatum. The significant advantage of this model is the high reproducibility by controlling the dosage of the bacterial collagenase, which can depict the PBI and the SBI with elevated intracranial pressure and hematoma formation followed by hematoma expansion [[34]]. The collagenase injection model shows hematoma increases in the first 4 h. Blood from the hemorrhagic area diffuses into the brain parenchyma after collagenase injection, increasing the hematoma volume. The hematoma volume was more significant in the collagenase injection model when compared to the blood injection model at 4 and 6 weeks [] [[35]].
Due to collagenase injection, it is easy to observe the time-dependent increase in the BBB leakage [[35][40]]. Since this model involves the formation and expansion of hematoma, toxic blood components such as free hemoglobin, heme, hemin, thrombin, and other factors affecting neurons can also be studied []. Various studies have further probed the molecular and cellular effects caused in the brain, including neuroinflammation, neuronal death, neutrophil infiltration, and microglial activation [[37]].
However, the major limitation of the collagenase injection model is the significant inflammation caused by the exogenous bacterial collagenase and the rupturing of small blood vessels around the area of collagenase injection, which is not the case in clinical situations; hemorrhages in the human brain are usually from the arterial source [[35]]. The use of collagenase induces vessels’ bursting, which results in significant bleeding even after hours of collagenase injection [[10]]. Maintaining the dosage of collagenase is critical in the collagenase injection model as higher dose of collagenase might induce an extensive inflammatory response causing neurotoxic effects in the animals [[38]]. The functional recovery of the animals can be monitored after 2 months of collagenase injection. In resemblance with the clinical outcomes of ICH, the functional neurological effects were diminished after 21 days postcollagenase injection [[39]-[40]]. Hence, this method can be used in the experimental setup as it is highly reproducible once the collagenase dose is stabilized.
Autologous blood injection
Autologous blood extracted from the tail vein infused into the striatum of the rats or mice with the help of an infusion system is closely similar to the clinical ICH [[41]]. The significant advantage of this model over other models is the sterility as it does not introduce any exogenous substance. Like the collagenase model, the autologous blood injection model causes mechanical damage associated with the mass effect [[41][42]]. The significant disadvantages of the blood injection model are the random blood penetration into the subarachnoid and ventricular spaces []. This model is less reproducible when compared to the collagenase model [] [[32][42][43]].
In terms of the hematoma size, unlike the collagenase model, which shows a constantly increasing hematoma size during the first 4 h, the blood injection model demonstrates a stable hematoma size during the first 4 h. The hematoma usually resolved as early as 4–6 weeks postblood injection [[35]]. The functional outcomes contrasted with the collagenase model as the animals showed complete neurological functional recovery after 21 days of blood injection. Neurological severity score and corner test showed a partial recovery from day 1 to day 28 postblood injection [[36][38]]. The animals which underwent blood injection ICH demonstrated deceased time-dependent BBB permeability; also, the BBB permeability was bound only to the rim of the hematoma [[35][44]].
Microballoon inflation
The first microballoon inflation model was developed in 1987 to study the mass effect caused by ICH. In this model, a microballoon was inserted stereotaxically into the right caudate nucleus of rats with the help of a guided cannula, and the coordinates are as follows; 1mm cranial and 4mm to the right of bregma; the balloon was inserted into a depth of 5 mm into the brain. The microballoon (embolization balloon) was inflated with 50 mL within 20 s and was kept for 10 min before it was deflated and removed from the rat brain [[45]-[47]]. This model effectively reduced the cerebral blood flow and increased the ICP of the animals, thereby demonstrating mass effect [[45]]. The animals also showed systemic effects on cerebral perfusion pressure [[47]]. The two major disadvantages of this method are the limited time window to perform balloon inflation and an extended period of balloon inflation might result in irreversible brain damage. Another disadvantage is the lack of hematoma formation. Hence, this model cannot study the SBI caused by the blood components secreted from the hematoma and perihematomal regions [] [[41][46]]. Studies show that microballoon inflation causes cell death by apoptosis from 6 h to 24 h after deflation. Furthermore, necrotic neurons were present in the animals after 10 min or 120 min postdeflation [] [[48]].
Thrombin injection model
The model is a replica of the blood model with the only difference of injecting only thrombin and not the whole blood into the animal brain. The model differs from the blood model in that only thrombin is injected into the animal brain []. This model’s significant advantage and disadvantage are knowing the importance of thrombin and not any other blood components involved in the SBI of ICH [[49][50]]. However, this model showed a cognitive deficit for 5 days postthrombin injection. One further study illustrated that thrombin did not play BBB disruption [[51][52]]. Yang et al. have also shown activated microglia and macrophages after intrastriatal thrombin injection [[51]].
Classic primary sources (abstracts)
Abstract
Intracranial bleeding is an important cause of brain masses and edema. To study the pathophysiology of intracerebral hemorrhage, we produced experimental hemorrhages in 53 rats and characterized the lesion by histology, brain water content, and behavior. Adult rats had 2 microliters saline containing 0.5 unit bacterial collagenase infused into the left caudate nucleus. Histologically, erythrocytes were seen around blood vessels at the needle puncture site within the first hour. By 4 hours there were hematomas, the size of which depended on the amount of collagenase injected. Necrotic masses containing fluid, blood cells, and fibrin were seen at 24 hours. Lipid-filled macrophages were observed at 7 days and cysts at 3 weeks. Water content was significantly increased 4, 24, and 48 hours after infusion at the needle puncture site and for 24 hours in posterior brain sections. Behavioral abnormalities were present for 48 hours, with recovery of function occurring during the first week. Brain tissue contains Type IV collagen in the basal lamina. Collagenase, which occurs in an inactive form in cells, is released and activated during injury, leading to disruption of the extracellular matrix. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage is a reproducible animal model for the study of the effects of the hematoma and brain edema.
Abstract
For experimental purposes, the most common technique of producing an intracerebral hematoma in rats is the injection of unclotted autologous blood. All modifications of this model share the problem that size and extension of the hematoma are not reproducible, because the injected blood either ruptures into the ventricular system or it extends to the subarachnoid or subdural space. Therefore a double injection model of experimental intracerebral hemorrhage in rats has been developed using 19 male Sprague-Dawley rats. After inducing anesthesia a cannula was stereotactically placed into the caudate nucleus and an intracerebral hematoma was produced with the double injection method in which first a small amount of fresh autologous blood is injected which is allowed to clot (preclotting) in order to block the way back along the needle track; the actual hematoma is produced in a second step of the injection. The clot volume was measured on stained serial sections. A total injection volume of 50 microliters of autologous blood produced intracerebral hematomas of 41.1 +/- 10.0 microliters and of similar shapes. The double injection method allows to generate reproducible hematomas in rats. This new model of intracerebral hemorrhage will allow further investigation of fibrinolytic and cytoprotective therapies.