先说明一点：本页正文不是对某篇论文的精译，而是一篇教科书级讲义——这一篇没有可用的开放全文（MIQE 原始文件 2009 年发表于 Clinical Chemistry，MIQE 2.0 于 2025 年发表在同一刊，两者均为订阅或需要权限）。页末的英文附录只是这两个版本公开摘要的忠实转录，不含正文条目清单。所以：中文正文里的做法，凡属公认操作我按“通行做法”写；凡属 MIQE 摘要明确提到的内容，我逐条标出；凡属 MIQE 2.0 摘要强调的新方向，单独标注。请把中文部分当作“实验课讲义”，而不是“某篇文献的译文”。

参考框架：Bustin SA 等，The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments，Clinical Chemistry 2009（DOI 10.1373/clinchem.2008.112797；PMID 19246619）；以及 MIQE 2.0，Clinical Chemistry 2025（DOI 10.1093/clinchem/hvaf043；PMID 40272429）。两篇的摘要见页末附录；正文中所有“MIQE 要求”的表述都能在摘要里找到依据，凡是摘要没有明说、属于我按通行做法补写的，已用“通行做法”标出。

一、qPCR 在测什么：从 RNA 到一条曲线

先把名字理清。中文常说的“qPCR”其实混着两件不同的事：实时定量 PCR（quantitative real-time PCR, qPCR） 指的是在扩增过程中边扩增边测信号；而测 RNA 表达时，前面还有一步逆转录（reverse transcription, RT），把 RNA 变成互补 DNA（complementary DNA, cDNA），所以严格的名字是 RT-qPCR。这两步各有各的失败方式，而很多“qPCR 结果不对”的案例，问题出在前一步。

反应本身很朴素：一条正向引物、一条反向引物夹住一段几十到两百个碱基的目标序列，DNA 聚合酶在每个循环里把它复制一遍。理想情况下，每个循环产物翻倍，跑 40 个循环就是 2⁴⁰ ≈ 10¹² 倍的放大——这就是为什么它能测到“一个细胞里几十个拷贝”这种量级。但“翻倍”只是理想，真实世界里每个循环只放大 1.8 倍、1.9 倍，甚至更少，这个偏差就是后面要讲的扩增效率。

“实时”靠的是荧光：要么用荧光染料（如 SYBR Green）嵌进双链 DNA，要么用带荧光标记的探针（如 TaqMan），探针在扩增时被切掉、荧光基团与淬灭基团分离而发光。仪器每个循环读一次荧光，把“循环数”与“荧光强度”画成一条 S 形曲线——这就是扩增曲线（amplification curve）。它有三段：基线期（信号淹没在背景噪声里）、指数期（荧光随循环近似对数增长）、平台期（引物耗尽、酶失活、产物抑制，信号不再增长）。

关键的一句话在这里：只有指数期的数据可以用来定量。平台期的荧光高低与起始模板量几乎无关，因为所有反应最后都跑到“试剂用完”为止。你看到的“这一孔的信号更强”，如果取在平台期，说明的只是“这一孔跑得更久”，不是“起始模板更多”。这也是为什么定量的锚点必须落在指数期——而落点的具体位置，就是下一个概念。

二、Ct 的含义与它的边界

循环阈值（threshold cycle, Ct；MIQE 2.0 更倾向写作 Cq，即 quantification cycle）的定义是：荧光信号第一次超过设定阈值时所处的循环数。阈值是一条人为画在指数期上的水平线，通常取基线噪声标准差的若干倍，或取指数期荧光上升段的固定比例。

为什么 Ct 能当定量指标？因为在指数期，荧光强度正比于产物量，而产物量正比于起始模板量乘以（每循环放大倍数）的循环数次方。把两边取对数，就得到一条直线关系：起始模板越多，越早到达阈值，Ct 越小。所以“Ct 小 = 起始模板多”这句话本身是对的。但它的成立有一串前提，边界就在这串前提上：

边界一：Ct 是循环数，是 log₂ 尺度的量。在效率 100% 时，Ct 相差 1 个循环对应 2 倍差异，相差 3.32 个循环对应 10 倍差异。所以“Ct 从 28 降到 25”不是“提高了 3”，而是“提高了约 8 倍”。把 Ct 当普通数值做加减、算平均值、做 t 检验，是新手最常犯的数学错误——正确做法是先换算成相对量（2⁻ᶜᵗ 或 2⁻ᵟᶜᵗ），再统计。

边界二：只有落在可信区间里的 Ct 才有意义。Ct 太小（如小于 15）说明模板太多，指数期太短，阈值可能落在仪器线性范围之外；Ct 太大（如大于 35）说明模板极少，此时单分子效应、引物二聚体、非特异产物都可能贡献信号。通行做法是把可报告区间大致定在 15–35 个循环，具体以仪器的动态范围为准。

边界三：Ct 可比的前提是效率可比。如果目标基因的扩增效率是 90%、内参是 105%，那么两者的 Ct 差会随循环数漂移，“ΔCt 恒定”这个假设就不成立。这条边界是第三节的全部内容。

边界四：Ct 反映的是 cDNA 里目标序列的量，而不是“mRNA 有多少”。中间隔着逆转录效率、RNA 完整性、引物位置（降解的 RNA 会优先丢掉 5′ 端，若引物设计在 5′ 侧，Ct 会假性升高）、以及基因组 DNA（gDNA）污染。任何一环出问题，Ct 都会变，而你看不出来。

把这四条合起来，可以说得更准确：“Ct 小 = 表达高”只在“同一批 cDNA、效率可比、Ct 落在可信区间、且没有 gDNA 干扰”这四个条件下成立。离开这些条件，Ct 仍然是个数，但它测的可能是别的东西。

三、扩增效率与那个 90–110%

扩增效率（amplification efficiency, E）的定义是：每个循环里，产物实际增加了起始量的百分之多少。写成倍数更直观：每循环放大倍数 = 1 + E。E = 100% 就是每循环翻一倍，这是理论最优；E = 90% 就是每循环放大 1.90 倍；E = 110% 就是 2.10 倍。所以 90%–110% 这个区间，翻译成人话就是“每个循环的放大倍数在 1.9 到 2.1 之间”——离“翻倍”不远，说明这套引物与反应条件是健康的。

为什么会偏离 100%？原因在反应本身：引物与模板的结合效率、扩增子的 GC 含量与二级结构、扩增子长度（通行做法建议 70–200 bp）、缓冲液里的盐与添加剂、dNTP 与酶的量、以及样品里带进来的抑制剂（肝素、SDS、乙醇、酚残留）。这些因素让“每个循环翻倍”变成一个近似，而不是定律。

怎么测？做标准曲线。把同一份 cDNA 做 10 倍系列稀释（至少 4–5 个点，每点 3 个复孔），每个稀释度跑一次 qPCR，得到各自的 Ct；以 log₁₀(相对起始量) 为横轴、Ct 为纵轴做线性回归，得到斜率（slope）。效率由斜率换算：

E = 10^(−1/slope) − 1

斜率 −3.32 对应 E = 100%；斜率 −3.1 与 −3.6 大致对应 110% 与 90%。所以你在方法里看到“斜率 −3.3，R² = 0.998”，就知道作者做过效率验证，且效率接近理想。通行做法还要求线性相关系数 R² ≥ 0.98（更严的实验室要求 0.99），并且标准曲线的模板必须与真实样品同源——用质粒标准品测出来的效率，与用 cDNA 测出来的效率不一定相同，因为 cDNA 里混着逆转录酶、残留引物与各种抑制物。

效率偏离有两种方向，含义完全不同：

效率偏低（低于 90%）：每循环放大不足。常见原因包括引物设计不佳、扩增子过长或 GC 过高、模板里有抑制剂、退火温度偏高。它本身不产生假信号，但会让“2⁻ᵟᵟᶜᵗ”这个经典公式失准，且低丰度样品更容易掉出可信区间。

效率偏高（高于 110%）：这几乎总是坏消息，而且最容易被误读成“我的引物特别好”。常见原因是引物二聚体、非特异扩增、或者同一体系里存在两个扩增目标（比如 gDNA 与 cDNA 同时被扩增）。另一种技术性原因是基线扣除窗口选得不对，导致阈值位置漂移，把斜率算“陡”了。看到效率 120%，正确的反应不是高兴，是去跑熔解曲线。

还有一条容易被忽略：目标基因与内参基因的效率必须各自合格，而且最好接近。原因见第六节——ΔΔCt 的经典公式默认“两者效率都接近 100%”。如果目标基因 90%、内参 105%，你可以继续用，但必须换成效率校正的计算方式，不能直接用 2⁻ᵟᵟᶜᵗ。

四、熔解曲线、NTC 与 NRT：三个“先看”

在比较任何两组数据之前，有三样东西必须先看。它们不产生漂亮的结论，但它们决定了后面的结论能不能成立。

① 熔解曲线（melt curve，又称解离曲线 dissociation curve）。做法是在扩增结束后，把样品从约 60 ℃ 缓慢升温到 95 ℃，同时连续读荧光：温度升到某个点时，双链 DNA 解开，染料脱落，荧光骤降。把荧光对温度求负一阶导数，得到一个峰，峰顶温度就是解链温度（melting temperature, Tm）。判读规则很简单：

· 单一、尖锐的峰——只有一个产物，引物是特异的；
· 低温处多出一个小峰（通常 70–75 ℃ 附近）——引物二聚体，它会在 NTC 里也出现；
· 多个峰或一个很宽的肩——非特异扩增，可能扩到了同源序列或 gDNA；
· 峰位与预期 Tm 差得远——扩增子不是你以为的那一段，回头查引物。

注意：熔解曲线的判读只对染料法（SYBR Green 类）有意义。探针法的特异性由探针保证，仪器通常不提供熔解程序——但这不等于探针法不会出错，探针降解、探针浓度不足同样会给出假信号，只是你要用别的方式查（如 NTC 与标准曲线）。

② NTC（no-template control，无模板对照）。用无核酸酶水代替 cDNA，其余成分不变。它检验的是“试剂与引物本身干不干净”。合格的标准是：无 Ct，或者 Ct 明显高于最低的样品 Ct（通行做法要求至少高 3–5 个循环，或落在 35 以上）。NTC 出现与样品同水平的信号，说明污染或引物二聚体严重，这一板的低丰度数据全部作废。

③ NRT（no-reverse-transcriptase control，无逆转录对照；也写作 −RT）。逆转录那一步不加逆转录酶，其余完全照做，然后同样跑 qPCR。它检验的是“信号是不是来自基因组 DNA”。因为此时体系里没有 cDNA，任何扩增都只能来自残存的 gDNA。NRT 有信号而 NTC 干净，是 gDNA 污染的典型指纹；处理办法是加 DNase I 消化、或把引物设计到跨外显子连接处（跨内含子引物），让基因组模板扩增不出来或扩增子明显偏大。

把三者的判读顺序记住：先看 NTC 与 NRT（污染问题），再看熔解曲线（特异物问题），再看 Ct 是否落在可信区间（丰度问题），最后才看组间差异（生物学问题）。顺序颠倒最常见的后果是：你花了三天解释一个“显著差异”，最后发现它来自 NTC 里那点引物二聚体。

④ 还有一类对照不该省：阳性对照。取一份已知高表达该基因的样本（比如某株细胞系、某个脑区），与样品同板跑。如果阳性对照的 Ct 也在 35 以上，那问题不在生物学，而在这一板的体系——酶、引物、程序、或者 RNA 质量。阳性对照还有一个附带好处：它给你一个“这套引物在最好的样本上能到什么 Ct”的基准，帮你判断样品里的低信号是“真的低”还是“根本没扩起来”。

五、内参基因怎么选（以及它在脑出血/缺血模型里为什么会变）

内参基因（reference gene，旧称管家基因 housekeeping gene）的作用是校正“每个样品到底放进去多少 cDNA”。你真正想比较的是“处理组目标基因的表达是对照组的几倍”，但两块 96 孔板之间、甚至同一板的两孔之间，总 RNA 量、逆转录效率、加样误差都会让 Ct 整体平移。内参的任务是把这个平移量测出来，然后减掉。

教科书上最常被点名的内参是：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin, ACTB）、18S 核糖体 RNA（18S rRNA）、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 1（HPRT1）、TATA 结合蛋白（TBP）、β2 微球蛋白（B2M）、酸性核糖体蛋白 P0（RPLP0）、磷酸甘油酸激酶 1（PGK1）、酪氨酸 3-单加氧酶/色氨酸 5-单加氧酶激活蛋白 ζ（YWHAZ）、β-葡萄糖醛酸酶（GUSB）。名字很多，但它们能用的前提只有一个：在你这个实验条件下，它自己的表达不随处理而变。

怎么验证这个前提？通行做法分三步。

第一步，候选筛查。取 3–5 个常用内参，在你的全部实验组（包括各个时间点、各个处理组）里各测一次 Ct，算组间变异。变异最小的那个（或那两个）才值得用。不要因为“大家都用 GAPDH”就直接用——那句话不是证据。

第二步，双内参。选两个在组间都稳定的内参，归一化时取它们的几何平均（不是算术平均，因为 Ct 是 log 尺度）。这一步的成本很低，收益很大：单个内参偶然波动时，双内参能把误差摊薄。文献里常见的 GeNorm、NormFinder、BestKeeper 就是做这件事的统计工具（属通行做法，MIQE 摘要未列出具体算法名）。

第三步，把验证写进方法。写清你筛了哪几个、用了哪两个、稳定性依据是什么（组间 Ct 的 SD 或变异系数）。这一段常常被省掉，但审稿人问“你怎么知道内参不变”时，它是唯一的答案。

为什么在脑出血/缺血模型里，内参特别容易“变”？因为这类模型同时扰动了内参赖以稳定的几个前提：

· GAPDH 是糖酵解通路的关键酶。缺血/缺氧时细胞从氧化磷酸化转向糖酵解，糖酵解相关基因的转录会被整体上调；而且 GAPDH 本身还参与凋亡、核转位与转录调控，并不是一个“只管看家”的蛋白。在这些模型里默认它不变，风险很高。

· β-actin 是细胞骨架成分。脑出血/缺血后的病灶区伴随神经元骨架解体、轴突损伤、星形胶质细胞增生与小胶质细胞活化，细胞类型构成在变，而 ACTB 在不同细胞类型里表达量差别很大——组织“成分变了”，测得的总 ACTB 自然就变了。另外它在脑组织里丰度极高、Ct 很低，微小的差异在 log 尺度上被压缩，反而更难发现它已经漂了。

· 18S rRNA 占总 RNA 的绝大部分（常说 80% 左右），由 RNA 聚合酶 I 转录，与 mRNA 的调控逻辑完全不同；它的 Ct 常在 10 以下，把仪器的动态范围吃掉一大截，而且逆转录时 rRNA 与 mRNA 的逆转录效率并不一致。用 18S 做内参，等于用一个“占绝对多数、且不受 mRNA 调控影响”的物种去校正 mRNA 的微量变化——数学上能算，生物学上讲不通。

· 更根本的一层：缺血/缺氧会全局性抑制翻译、改变 RNA 的稳定性与降解速率。任何“持家基因”的假设，在这个背景下都必须重新验证。

所以给一个可执行的经验：在这类模型里，至少用两个内参，并在你的模型里实测一次稳定性；如果两个内参给出的结论方向相反，先别急着解释生物学，先怀疑归一化。另外还有一条兜底办法——用与 PCR 无关的量做交叉验证：同一批样品跑 WB 看蛋白层面、或用总 RNA 投入量/细胞数做绝对化对照。如果 qPCR 说“上调 3 倍”而 WB 说“没变”，通常不是 WB 不灵敏，而是某一环的归一化出了问题。

六、ΔΔCt 的计算与它成立的前提

ΔΔCt 法（comparative Ct method，文献里常称 Livak 法）是相对定量最常用的算法。它的思路只有两步减法加一次指数：

① ΔCt = Ct(目标基因) − Ct(内参基因)。这一步把“上样量差异”减掉；
② ΔΔCt = ΔCt(处理组) − ΔCt(对照组均值)。这一步把“处理带来的变化”单独拎出来；
③ 相对表达量 = 2^(−ΔΔCt)。对照组自己比自己是 1，处理组是几倍，一眼就能读出来。

举个具体的小例子：对照组目标基因 Ct = 25.0、内参 Ct = 20.0，ΔCt = 5.0；处理组目标 Ct = 23.0、内参 Ct = 20.0，ΔCt = 3.0。于是 ΔΔCt = 3.0 − 5.0 = −2.0，相对量 = 2^(−(−2.0)) = 2² = 4 倍。注意对照组的内参 Ct 与处理组相同——这正是“内参稳定”假设在工作中的样子。

这个算法漂亮、便宜、几乎每篇论文都在用，但它有五个前提，缺一个就要换算法：

前提一：目标基因与内参基因的扩增效率都接近 100%，且彼此接近。这才是 2^(−ΔΔCt) 里那个底数 2 的来源。如果效率分别是 90% 与 105%，正确做法是换成效率校正公式：相对量 = (1+E_目标)^(−ΔCt目标) ÷ (1+E_内参)^(−ΔCt内参)，其中 E 用标准曲线的斜率算出来。

前提二：内参在组间稳定。上一节整节都在讲这件事。内参漂了，ΔCt 的差就不再是“目标基因的变化”，而是“目标基因变化 + 内参变化”的混合物，且两者无法从数据里分开。

前提三：所有样品在同一块板、同一批试剂上跑。跨板比较需要板间校准品（inter-plate calibrator，IPC），否则板间的 Ct 偏移会被误读成生物学差异。这也是为什么“补做几个样品”往往要和原来的板一起重跑。

前提四：Ct 落在可信区间，且每个样品有技术重复。通行做法是每个样品 3 个技术复孔、至少 3 个生物学重复。技术重复衡量的是“加样与仪器”的误差，生物学重复才是你要做统计的对象——把两者混起来算 n，是最常见的统计造假（哪怕无意）。

前提五：对照组的 ΔCt 是多个生物学重复的均值，不是一个样品的值。直接拿“对照组第一号样品”当分母，会让整个数据集的倍数随这个样品的运气而整体放大或缩小。

最后说误差。2^(−ΔΔCt) 是一次指数变换，小的 ΔCt 误差会被放大成大的倍数误差。举例：如果 ΔΔCt 的标准误是 0.3，那么 95% 置信区间大约对应 0.66 倍到 1.5 倍——也就是说，一个“1.5 倍”的差异，其区间是跨过 1 的，按统计讲还不能算差异。这就是为什么“只报 fold change、不报 Ct 与误差”的论文不可信：你无法判断那个倍数是不是噪声。可接受的报告方式是：给出各组的 Ct 均值、ΔCt、ΔΔCt、倍数、n、离散度与检验方法；最好再给原始数据（每孔 Ct）。

七、绝对定量与相对定量

这两个词经常被混着用，但它们回答的是两个不同的问题：相对定量回答“处理组比对照组多几倍”，绝对定量回答“每微升里有多少个拷贝”。前者只需要 Ct 的差值，后者需要一条标准曲线（standard curve）把 Ct 换算成拷贝数。

相对定量的优点是不需要标准品、不需要知道逆转录效率、成本低，适合绝大多数“处理前后表达变化”的机制研究。它的代价是：你得到的数字没有绝对意义。说“上调 2.3 倍”，前提是内参稳定、效率接近 100%、“对照组的 1”这个基准经过同样的处理——换一个内参，这个倍数可能变成 1.6。所以相对定量的倍数永远不要跨实验、跨课题比较。

绝对定量的做法是：用已知拷贝数的标准品（含目标序列的质粒、或体外转录的 RNA、或合成的双链 DNA）做梯度稀释，跑出标准曲线（通常要覆盖 5–6 个数量级，因为样品的 Ct 跨度可能很大），然后用样品的 Ct 在曲线上反查拷贝数。报告时要写清单位：copies/µL cDNA、copies/ng 总 RNA、或 copies/细胞（这需要另测细胞数）。

这里必须诚实一句：RT-qPCR 的“绝对”是有限度的。标准曲线给的是“cDNA 里有多少个拷贝”，而从“细胞里有多少个 mRNA 分子”到“cDNA 里有多少个拷贝”，中间还有逆转录效率这一步，它通常未知、且随序列与 RNA 二级结构变化。所以严格说，RT-qPCR 给出的是相对可比的绝对量：同一批逆转录、同一套标准品之间可比，跨批、跨方法就不一定。数字 PCR（digital PCR, dPCR）可以免去标准曲线，但同样绕不过逆转录效率这一关。

什么时候该用哪个？经验划分：机制研究（处理后表达升高/降低、时间进程、剂量反应）用相对定量；病毒载量、转基因拷贝数、标准品标定、病原体检测这类要报“每毫升多少个”的，用绝对定量。另外 MIQE 2.0 摘要里提到的检出限（limit of detection, LoD）与动态范围（dynamic range），主要是绝对定量与低丰度检测要交代的参数——相对定量里“最低能测到多少”也必须心里有数，否则“未检出”会被误读成“不表达”。

八、MIQE 要求报告什么

MIQE 的全称是“发表定量实时 PCR 实验所需的最小信息”（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）。摘要里对它的定位说得非常克制：它是一份为作者准备的投稿检查表（checklist），列的是“评估一次 qPCR 实验所需的最小信息”，并且要求完整披露试剂、序列与分析方法；它也可以被缩写，或作为在线补充材料提交。

请注意这个定位里的三个词：最小、完整、披露。它不评价你的结论对不对，只要求“别人拿你的方法部分，能判断这次实验值不值得信、能不能重复”。所以下面这张表不是“必做实验清单”，而是“必写信息清单”。

这张表里有一行值得单独说：最后一行“Cq 应换算为效率校正后的靶标量并报告预测区间”。这是 MIQE 2.0 摘要里明确写出的新方向，也是最容易被忽略的一条——它意味着“直接报 2^(−ΔΔCt)”在严格意义上已经不够了。理由不难理解：2^(−ΔΔCt) 的前提是效率 100%，而这个前提很少被逐条验证；效率校正后的量与预测区间，才是“在给定效率与误差下，我估计这个靶标有多少”的完整表述。你在本科阶段不必立刻改算法，但要知道自己写的那个倍数附带了哪些没写出来的假设。

MIQE 2.0 摘要还有一个信号：它说报告要求被精简了。这不是放松，而是把重点从“列长清单”转向“讲清数据质量与统计”。理解这一点，你就能看懂这些年 qPCR 论文的方法部分为什么越来越短、却越来越强调“效率、对照、归一化、原始数据”。

九、qPCR 最常见的五个坑

① RNA 降解与纯度：A260/280 不能证明“没降解”。A260/280 约 1.9–2.1（RNA）只说明蛋白与酚类污染少，与 RNA 是否断裂是两件事。判断完整性要看RNA 完整性指标（RNA integrity number, RIN）或变性凝胶上的 28S/18S 条带比例。降解的 RNA 有一个隐蔽后果：它偏向 3′ 端保留、5′ 端丢失，所以引物设计在 5′ 侧的目标基因 Ct 会假性升高，看起来像“表达下降”。同时别忘了 A260/230——胍盐与乙醇残留会抑制逆转录与 PCR，症状是“所有基因的 Ct 都偏大”。

② 引物二聚体。症状是 NTC 里有 Ct、熔解曲线在 70–75 ℃ 出现小峰、低丰度样品“莫名其妙地有个信号”。它特别危险，因为它的 Ct 常常正好落在低表达基因的区间里，让你以为“检出微弱表达”。处理办法：降低引物浓度、提高退火温度、重新设计引物（避免 3′ 端互补），并把 NTC 的 Ct 写进方法。

③ 内参不稳。第五节的整篇内容。在脑出血/缺血这类模型里，GAPDH、β-actin、18S 都可能随处理改变；内参变了，所有倍数一起变，而数据内部看不出破绽。这是“结论正确但数字错”的典型来源——方向可能还对，倍数完全不可信。

④ 把 Ct 当表达量。Ct 是循环数，是 log₂ 尺度；Ct 小意味着起始模板多。直接把 Ct 拿去做 t 检验、算平均值、画柱状图，等于对 log 值做算术平均，得到的是“几何平均的倒数”，结论可能整个反过来。正确做法是先算 ΔCt（或 2^(−ΔCt)），再统计。

⑤ 只报 fold change，不报原始数据。没有 Ct 均值、没有内参、没有 n、没有离散度、没有对照情况，读者无法判断那个 2.3 倍是不是噪声。前面算过：ΔΔCt 的标准误 0.3，95% 区间就跨到 0.66–1.5 倍——很多“显著上调”其实在这个区间里。可接受的报告格式是：各组 Ct（mean ± SD）、ΔCt、ΔΔCt、倍数、n、检验方法，最好附每孔原始 Ct。

十、以你现在的水平能亲手做到哪一步

可以自己来：RNA 提取（按试剂盒流程，注意冰上与 RNase-free 操作）、浓度与纯度测定（NanoDrop 类仪器的 A260/280、A260/230）、cDNA 合成（照试剂盒配体系、设程序）、配 qPCR 反应体系与排板（多练几板就会）、上机跑程序、导出 Ct 与熔解曲线、用 Excel 做 ΔΔCt 计算与画图。

必须在师姐看着时做：引物设计与验证（设计错一次要重来一周）、标准曲线与效率计算（稀释系列怎么配、几个点、R² 多少算过）、内参的选择与稳定性验证（这决定后面所有数字的意义）、判断一块板能不能用（NTC 有小信号时该作废还是可接受）、以及“这批样品要不要重提 RNA”这种判断。

现在还轮不到你独立判断：这个模型该用哪个内参；两组之间 1.5 倍算不算差异；跨板数据能不能拼；以及最关键的那一句——“我这个 qPCR 结果和 WB 对不上，是谁错了”。

把这一页压成一句：qPCR 给出的从来不是“表达量”，而是一串以循环数为单位、以假设为地基的差值。你算出的每一个倍数，都在替你做一堆你没有写出来的假设投票——效率接近 100%、内参稳定、Ct 在可信区间、没有 gDNA、没有引物二聚体、重复足够。MIQE 存在的意义，就是逼你把这张选票的存根留下。

附录 · 英文原文

⚠ 以下仅为 MIQE 2009 与 MIQE 2.0 两篇文献公开摘要的忠实转录，不含正文条目清单与补充材料。原文本体需订阅权限，本页未作转述之外的内容填充；中文正文为讲义，不是对这两篇摘要的精译。DOI：10.1373/clinchem.2008.112797 与 10.1093/clinchem/hvaf043。